نام آزمایش: Banding(C/NOR/R/Q-band) (روش هاي نوار بندي اختصاصي غير از G-Banding)
نام اختصاری: Banding(C/NOR/R/Q-band)
نام بخش: Cytogenetics
نمونه مورد نیاز: خون وریدی (با ضد انعقاد هپارین)، مغز استخوان (CSF)، نمونه های بافتی.
معرفی نوار بندی کروموزومی
نوار بندی کروموزومی (Chromosome Banding) تکنیک هایی هستند که جهت شناسایی الگوهای خاص روی کروموزوم ها استفاده می شوند و در سیتوژنتیک برای تشخیص ناهنجاری های کروموزومی کاربرد دارند. علاوه بر G-Banding (رایج ترین روش)، روش های دیگری نیز وجود دارند که هرکدام ویژگی های خاصی از کروموزوم ها را نشان می دهند.
انواع روش های Chromosome Banding غیر از G-Banding
۱) C-Banding (Centromeric Banding)
شناسایی ناحیه های هتروکروماتین، به ویژه در سنترومرها و نواحی نزدیک به آن.
- کاربرد:
- □ مطالعه ساختار سانترومرها
- □ تشخیص واریانت های طبیعی (هتروکروماتین اضافی)
- □ بررسی کروموزوم های Y (در تعیین جنسیت)
۲) NOR-Banding (Nucleolar Organizer Region Banding)
شناسایی نواحی سازنده هستک (NOR) که حاوی ژن های rRNA هستند.
- کاربرد:
- □ مطالعه کروموزوم های آکروسانتریک (کروموزوم های ۱۳, ۱۴, ۱۵, ۲۱, ۲۲ در انسان)
- □ بررسی فعالیت رونویسی rRNA
۳) R-Banding (Reverse Banding)
ایجاد الگوی معکوس G-Banding (نواحی که در G-band روشن هستند، در R-band تیره میشوند و بالعکس)
- کاربرد:
- □ بررسی نواحی تلومری و تشخیص حذف های انتهایی کروموزوم ها
- □ مطالعه کروموزوم هایی که با G-banding به خوبی قابل تحلیل نیستند
۴) Q-Banding (Quinacrine Banding)
ایجاد الگوهای نواربندی مشابه G-banding، اما با استفاده از فلوئورسنت
- کاربرد:
- □ تشخیص پلی مورفیسم های طبیعی (افزایش روشنایی در کروموزوم Y)
- □ مطالعه کروموزوم های گیاهی و حیوانی
موارد توصیه به انجام آزمایش
- □ C-Banding: تشخیص واریانت های طبیعی هتروکروماتین، بررسی کروموزوم Y در ناباروری، شناسایی مارکرهای کروموزومی، مطالعه کروموزوم های حیوانی و گیاهی
- □ NOR-Banding: تشخیص جابجایی های کروموزومی در کروموزوم های آکروسانتریک، بررسی فعالیت rRNA در سرطان ها، مطالعه ناباروری و سقط های مکرر
- □ R-Banding: شناسایی حذف های تلومری، شناسایی بازآرایی های پیچیده در سرطان ها، تأیید ناهنجاری هایی که در G-banding مبهم هستند
- □ Q-Banding: تعیین جنسیت، تشخیص پلی مورفیسم های طبیعی، مطالعه کروموزوم های حیوانی
آمادگی قبل از آزمایش
نیازی به ناشتایی نمی باشد. لازم است در صورت مصرف دارو، با پزشک مشورت کرده و یا به کارشناس آزمایشگاه اطلاع داده شود.
روش انجام آزمایش
- □ کشت سلولی و تهیه کروموزوم ها: شامل مراحل: الف) نمونهگیری ب) کشت سلولی ج) توقف تقسیم در متافاز د) هیپوتونیک تیمنت ه) فیکساسیون) تهیه لام ه) رنگ آمیزی
- □ روش های اختصاصی نواربندی:
- 1) C-Banding: الف) هیدرولیز اسیدی تیمار لام با 2/0N HCl، ب) تیمار با باز (Ba(OH)₂)، ج) شستشو با آب مقطر، د) انکوباسیون در بافر نمکی (SSC)، و) رنگ آمیزی گیمسا، ه) مشاهده با میکروسکوپ نوری
- 2) NOR-Banding: الف) پیشتیمار (با N0/1 HCl)، ب) شست شو با آب مقطر، ج) تیمار با نیترات نقره، د) شستشو و خشککردن، و) مشاهده با میکروسکوپ نوری
- 3) R-Banding: الف) پیشتیمار حرارتی (۸°C در بافر فسفات)، ب) رنگ آمیزی گیمسا، ج) مشاهده با میکروسکوپ نوری/ فلورسنت
- 4) Q-Banding: الف) رنگ آمیزی با کیناکرین، ب) شستشو با آب مقطر، ج) مشاهده زیر میکروسکوپ فلورسنت (UV ۴۶۰ نانومتر)
دامنه مرجع
- 1) C-Banding: □ نواحی تیره: نواحی سانترومری و هتروکروماتین، □ نواحی روشن: یوکروماتین
- 2) NOR-Banding: □ نواحی سیاه – قهوه ای: نواحی NOR فعال، □ نواحی زرد – نقره ای: سایر نواحی
- 3) R-Banding: □ نواحی تیره: نواحی غنی از GC (تلومرها)، □ نواحی روشن: نواحی غنی از AT
- 4) Q-Banding: □ فلورسنت روشن: نواحی غنی از AT، □ کم فلورسانس: نواحی غنی از GC
عوامل افزایش دهنده کیفیت باندینگ
- □ کیفیت نمونه های کروموزومی: تازه بودن نمونه، کیفیت گسترش کروموزوم ها، متافازهای با کروموزوم های بلند و بدون همپوشانی
- □ شرایط بهینه هضم آنزیمی: غلظت و زمان مناسب تریپسین، دمای مناسب (37°C)
- □ زمان و دمای مناسب رنگ آمیزی: Giemsa staining برای G-banding، حرارت کنترلشده در محلول بافر قبل از رنگ آمیزی برای R-banding
- □ شرایط بافر و pH: بافر فسفات یا مخصوص NOR-banding، تنظیم دقیق pH
- □ زمان و دمای انکوباسیون: برای C-banding و NOR-banding، استفاده از Ba(OH)₂ یا HCl با غلظت و دمای مناسب
- □ کیفیت میکروسکوپ و تصویربرداری: استفاده از عدسی های با کیفیت و نرم افزارهای تحلیل سیتوژنتیک
عوامل کاهش دهنده کیفیت باندینگ
- □ آلودگی نمونه: وجود چربی، پروتئین یا بقایای سلولی
- □ شرایط نامناسب ذخیره سازی: نمونههای قدیمی یا فیکس شده نامناسب
- □ pH نامناسب بافرها: در R-banding، باعث الگوی معکوس باندینگ میشود
- □ نوردهی بیشازحد در فلورسانس (Q-band و R-band)
- □ دمای نامناسب: در C-banding، هضم قلیایی در دمای بالا کروموزومها را تخریب میکند
- □ عدم تناسب غلظت رنگها: رنگ Giemsa بیش از حد یا کم
- □ زمان نامناسب هضم یا رنگآمیزی: هضم طولانیمدت با تریپسین در G-banding جزئیات را از بین میبرد
عوامل ایجاد کننده تداخل در آزمایش
1) نتایج مثبت کاذب
- □ آلودگی نمونه: DNA یا پروتئین های دیگر باعث باندهای غیراختصاصی
- □ شرایط نامناسب هضم آنزیمی: هضم بیشاز حد یا کم باعث مناطق غیراختصاصی میشود
- □ حرارت یا دناتوراسیون نادرست: در R-band الگوی باندینگ تغییر میکند
- □ تنظیم نادرست pH یا زمان رنگآمیزی: در Q-band، فلورسانس غیراختصاصی
- □ نور پس زمینه یا فیکس نامناسب: در Q-band سیگنال های غیر واقعی ایجاد میشود
2) نتایج منفی کاذب
- □ کیفیت پایین کروموزوم ها: کروموزوم ها فشرده یا تخریب شده
- □ زمان ناکافی رنگ آمیزی: باندها مشخص نمیشوند
- □ مشکلات در پروب یا هیبریداسیون (NOR-band)
- □ شرایط نامناسب میکروسکوپی: سیگنال ضعیف در Q-band
- □ کمبود مواد شیمیایی: غلظت ناکافی Ba(OH)₂ یا نمکها در C-band