نام آزمایش: Amino Acid Chromatography (اندازه گيري كمّي آمینو اسید ها با استفاده از كروماتوگرافي ستوني)
نام اختصاری: aach
نام بخش: بیوشیمی تخصصی
نمونه مورد نیاز: پلاسمای خون وریدی، ادرار 24 ساعته، مواد غذایی
اندازه گیری کمّی آمینو اسید ها با استفاده از کروماتوگرافی ستونی (Column Chromatography) یکی از روش های کلاسیک و دقیق جهت جداسازی و تعیین غلظت آمینواسیدها در نمونه های بیولوژیکی، غذایی و یا بالینی می باشد. این روش معمولاً بر پایه کروماتوگرافی تبادل یونی (Ion-Exchange Chromatography) انجام شده و در آن، آمینواسیدها بر اساس ویژگی های شیمیایی مانند: بار الکتریکی، اندازه و قطبیت از یکدیگر جدا می شوند.
آمینواسیدها به دلیل داشتن گروه های عاملی مختلف (آمینو، کربوکسیل و زنجیره جانبی) در pHهای متفاوت، بارهای الکتریکی متفاوتی دارند. در کروماتوگرافی تبادل یونی، از یک ستون پر شده با رزین تبادل یونی (رزین سولفونات برای تبادل کاتیونی) استفاده می شود. آمینواسیدها بر اساس تمایل به جذب روی رزین و سپس شستشو با بافرهای با pH و قدرت یونی متفاوت، جدا می شوند. در این روش، دو فاز وجود دارد، یک فاز متحرک و یک فاز ساکن.
1) فاز ساکن: رزین تبادل یونی (سولفونات پلی استایرن جهت جداسازی کاتیون ها).
2) فاز متحرک: بافرهای آبی با pH و غلظت یونی کنترل شده (بافرهای سیترات سدیم یا لیتیم).
چه زمانی انجام آزمایش Amino Acid Chromatography توصیه می شود؟
□ تشخیص اختلالات متابولیک مرتبط با آمینواسیدها در علم پزشکی (فنیل کتونوریا).
□ انجام تحقیقات بیوشیمیایی جهت مطالعات در مورد آنزیم ها و متابولیسم.
□ استفاده جهت بررسی تجزیه ترکیبات پروتئینی در علوم غذایی.
آمادگی قبل از آزمایش:
12-8 ساعت ناشتایی نیاز می باشد. لازم است، در صورت استفاده از دارو با پزشک مشورت کرده و یا به کارشناس آزمایشگاه اطلاع داده شود.
روش انجام آزمایش:
کروماتوگرافی تبادل یونی (Ion-Exchange Chromatography)
دامنه مرجع
نمونه خون وریدی
| (µmol/L) | نام اسید آمینه |
| 500-250 | آلانین |
| 150-60 | آرژنین |
| 100-40 | آسپاراژین |
| 60-25 | سیستئین |
| 800-400 | گلوتامین |
| 400-200 | گلیسین |
| 120-70 | هیستیدین |
| 110-50 | ایزولوسین |
| 200-100 | لوسین |
| 250-150 | لیزین |
| 40-20 | متیونین |
| 80-40 | فنیل آلانین |
| 300-100 | پرولین |
| 150-80 | سرین |
| 250-120 | ترئونین |
| 80-40 | تریپتوفان |
| 90-40 | تیروزین |
| 300-200 | والین |
نمونه ادرار (۲۴ ساعته)
| (mg/day) | نام اسید آمینه |
| 300-80 | گلیسین |
| 400-100 | هیستیدین |
| 200-50 | پرولین |
| 300-100 | لیزین |
| 100-30 | فنیل آلانین |
نمونه مواد غذایی
| (mg/100g) | منبع غذایی | نام اسید آمینه |
| 2500-2000 | گوشت گاو | لیزین |
| 500-400 | تخم مرغ | متیونین |
| 400-300 | گندم | ترئونین |
| 50-40 | شیر | تریپتوفان |
| 2200-1800 | سویا | والین |
□ افزایش سطح:
* نوزادان: غلظت برخی آمینواسیدها (مانند فنیل آلانین) بالاتر است.
* فنیل کتونوریا (PKU): فنیل آلانین خون > ۱۲۰۰ µmol/L.
* نارسایی کلیوی: افزایش سطح اکثر آمینواسیدها در ادرار.
□ کاهش سطح:
* سالمندان: کاهش سطح گلوتامین و آرژنین مشاهده می شود.
عوامل افزایش دهنده سطح Amino Acid در نمونه کدامند؟
□ فنیل کتونوریا (PKU): افزایش شدید اسید آمینه فنیل آلانین به دلیل نقص آنزیم فنیل آلانین هیدروکسیلاز.
□ بیماری ادراری شربت افرا (MSUD): افزایش آمینواسیدهای شاخه دار (لوسین، ایزولوسین، والین).
□ هموسیستینوریا: افزایش اسید آمینه هموسیستئین به دلیل وجود نقص در متابولیسم متیونین.
□ نارسایی کلیوی: کاهش دفع آمینواسیدها از طریق ادرار و تجمع آنها در خون.
□ آسیب کبدی: عدم متابولیسم صحیح آمینواسیدها به علت کبد ناسالم (در سیروز کبدی).
□ تومورها: افزایش سطح اسید آمینه تریپتوفان در صورت ایجاد برخی تومورها (کارسینوئید).
□ رژیم غذایی سرشار از پروتئین: مصرف زیاد پروتئین حیوانی و یا مکمل های آمینواسیدی.
□ استرس یا عفونت: افزایش کاتابولیسم پروتئین ها و آزادسازی آمینواسیدها در خون.
□ ورزش شدید: تجزیه پروتئین های عضلانی و افزایش موقت آمینواسیدهای شاخه دار در خون.
عوامل کاهش دهنده سطح Amino Acid در نمونه کدامند؟
□ سوءتغذیه یا کمبود پروتئین: کاهش کلی سطح آمینواسیدها به خصوص در کودکان (کواشیورکور).
□ اختلالات جذب روده: بیماری هایی مانند سلیاک و کرون.
□ بیماری های کبدی پیشرفته: کاهش سنتز آمینواسیدها توسط کبد (کاهش آلانین و گلوتامین).
□ اختلالات متابولیک: وجود نقص در سنتز آمینواسیدهای خاص (کاهش کارنیتین در برخی اختلالات مادرزادی).
□ رژیم غذایی کم پروتئین و یا گیاه خواری: کاهش دریافت آمینواسیدهای ضروری مانند: لیزین یا متیونین.
□ بارداری: کاهش سطح برخی آمینواسیدها به علت افزایش نیاز به آمینواسیدها برای رشد جنین.
□ برخی داروها: برخی آنتی بیوتیک ها (نئومایسین)، داروهای شیمی درمانی.
عوامل ایجاد کننده تداخل در آزمایش Amino Acid Chromatography چه هستند؟
1) عوامل ایجاد کننده نتایج مثبت کاذب:
□ آلوده شدن نمونه.
□ تجزیه پروتئین ها و افزایش آمینواسیدهای آزاد در صورت تاخیر در انجام آزمایش.
□ آزادسازی آمینواسیدها از گلبول های قرمز تخریب شده در اثر همولیز نمونه خون.
□ واکنش نین هیدرین با ترکیبات غیرآمینواسیدی (آمونیاک، اوره یا برخی داروها) و ایجاد رنگ مشابه.
□ حضور پرولین یا هیدروکسی پرولین، که در طول موج متفاوت (۴۴۰ نانومتر) جذب دارند، اما ممکن است به اشتباه در طول موج ۵۷۰ نانومتر خوانده شوند.
□ جداسازی ناکامل آمینواسیدها با بار مشابه (گلوتامات و آسپارتات) و تشخیص اشتباه به علت هم پوشانی پیک ها در کروماتوگرافی.
2) عوامل ایجاد کننده نتایج منفی کاذب:
□ هیدرولیز ناکامل پروتئین ها.
□ اتصال ناکامل آمینواسیدها به رزین تبادل یونی به علت pH نامناسب (بالاتر از ۳).
□ شستشوی بیش از حد ستون با بافرهای قوی.
□ جذب سطحی آمینواسیدها به دیواره ستون یا لوله ها.
□ قرارگیری طولانی مدت نمونه در دمای بالا یا نور مستقیم.
□ غلظت بسیار پایین آمینواسیدها (زیر حد تشخیص دستگاه).
□ رقیق سازی بیش از حد نمونه پیش از انجام آنالیز.