اثرات ضد قارچی و هم افزایی عصاره های آبی و الکلی چای سبز

اثرات ضد قارچی و هم افزایی عصاره های آبی و الکلی چای سبز با داروهای ایتراکونازول و وریکونازول بر روی گونه های آسپرژیلوس

فرنوش سرخانی مقدم MSc

گروه میکروبیولوژی، واحد کرج، دانشگاه آزاد اسلامی،کرج، ایران.

محمدهادی فکور PhD

گروه میکروبیولوژی، واحد کرج، دانشگاه آزاد اسلامی،هیدج، ایران.

آذر سب کبار* PhD

گروه میکروبیولوژی، واحد کرج، دانشگاه آزاد اسلامی،کرج، ایران.

مهدیس ابراهیم زاده PhD

گروه میکروبیولوژی، واحد کرج، دانشگاه آزاد اسلامی،کرج، ایران.

چکیده

اهداف: در این مطالعه، جایگزنی ترکیبات طبیعی مانند چای سبز بجای استفاده از داروهای شیمیایی ایتراکونازول و وریکونازول بررسی شد.

مواد و روش ها: در این پژوهش میزان اثرات ضد قارچی عصاره های آبی و متانولی چای سبز و همچنین اثرات هم افزایی این دو عصاره با دو داروی ایتراکونازول و وریکونازول بر روی چهار سویه آسپرژیلوس مطابق روش رقت در پلیت الایزا با تعیین حداقل غلظت مهاری و حداقل غلظت قارچ کشی موردبررسی قرار گرفت.

یافته ها: دوسویه آسپرژیلوس فلاووس 39 ATCC  و آسپرژیلوس ترئوس274ATCC  نسبت به داروی ایتراکونازول حساس و دوسویه دیگر مقاوم بودند. تمامی 4 سویه موردبررسی نسبت به وریکونازول مقاوم بودند. دو عصاره آبی و متانولی چای سبز، اثر ضد قارچی از خود نشان ندادند اما اثرات هم افزایی در ترکیب عصاره آبی چای سبز و ایتراکونازول در دو سویه آسپرژیلوس فومیگاتوس   278ATCC  و آسپرژیلوس نایجر9142 ATCC ارزشمند بود و همچنین دو ترکیب عصاره متانولی چای سبز و ایتراکونازول در آسپرژیلوس نایجر 9142 ATCC و دو ترکیب عصاره آبی چای سبز و وریکونازول بر روی آسپرژیلوس فلاووس  39 ATCC و آسپرژیلوس فومیگاتوس 278ATCC ارزشمند گزارش شد.

نتیجه گیری: نتایج حاصل از این پژوهش بیانگر وجود اثرات هم افزایی ارزشمندی بین ترکیبات داروها و عصاره های مورد آزمایش

بود.

کلید واژه ها: چای سبز، ایتراکونازول، وریکونازول، آسپرژیلوس.

 

مقدمه

 

گونه های آسپرژیلوس دسته ای از قارچ های رشته ای هستند که عموماً در خاک، سبزیجات در حال فساد و دانه ها به عنوان قارچ های ساپروفیت رشد می کنند. آسپرژیلوس ها گهگاه می توانند برای سلامتی انسان مضر باشند. در بین 200 گونه شناخته شده از آسپرژیلوس ها فقط تعداد کمی از آ ن ها می توانند باعث بیمار یهای عفونی در انسان شوند.

از بین گونه های آسپرژیلوس 5 گونه مهم آن شامل آسپرژیلوس فومیگاتوس، آسپرژیلوس ترئوس، آسپرژیلوس فلاووس، آسپرژیلوس نایجر و آسپرژیلوس نیدولانس می باشند که در این بین، اولین و مهم ترین گونه بیمار یزای آن آسپرژیلوس فومیگاتوس می باشد. کونیدی های آسپرژیلوس ها در هوا پراکنده بوده و با توجه به سیستم ایمنی افراد، طیف وسیعی از بیماری ها را می توانند ایجاد کنند شامل: ایجاد عفونت در بیماران مبتا به آسم و سیستیک فایبروزیز، آسپرژیلوزیس مهاجم ( IA )، آسپرژیلوزیس برونکوپولمونری آلرژیک، آسپرژیلوزیس پولمونری مزمن.

آسپرژیلوس ها نسبت به داروهای ضد قارچی گروه تری آزول ها شامل ایتراکونازول و وریکونازول حساس می باشند ولی اخیراً مقاومت برخی گونه ها به ویژه آسپرژیلوس فومیگاتوس نسبت به این گروه از داروها مشاهد هشده است. مطالعات نشان داده است، علت این مقاومت دارویی، ایجاد یک موتاسیون نقط های در ژن سیتوکروم P51A می باشد که مانع سنتز ارگوسترول می شود.

بنابراین چنین مقاومت هایی که در برخی آسپرژیلوس ها نسبت به داروهای گروه آزول ها مشاهده شده است، و از طرفی عوارض جانبی که مصرف داروهای شیمیایی می توانند در بدن ایجاد کنند، ضرورت نیاز به یکسری ترکیبات ضد قارچی جدید مانند گیاهان دارویی شامل چای سبز را دوچندان کرده است. چای سبز محبو بترین نوشیدنی در سرتاسر جهان است که از برگ های گیاهی با نام علمی Camellia sinensis گرفته شده است. چای سبز دارای ترکیباتی مانند پلی فنول ها و آلکالوئیدها شامل:فللاوونول ها، فلاوونوئیدها، و فنولیک اسیدها هستند. پلی فنولها با نام عمومی کاتچین ها، بیشترین ترکیبات موجود در برگ های چای سبز هستند که تقریبا 30 % وزن خشک چای سبز را تشکیل میدهند.

کاتچین های موجود در چای سبز دارای فعالیت آنتی اکسیدانی قوی به علت حضور ترکیباتی مانند کاتچین C، اپی کاتچین  EC ، اپی گالوکاتچین  EGC،اپی کاتچین 3 گالاته  ECG  و اپی گالو کاتچین 3 گالاته EGCG می باشد. پلی فنول های موجود در چای سبز شامل یکی از قدرتمند ترین پلی فنول های آنتی اکسیدان موجود در چای سبز EGCG اپی گالو کاتچین گالات می باشد که دارای خواص پزشکی بوده و برای درمان بسیاری از بیماری ها از آن استفاده می شود.

همچنین چای سبز دارای مقدار کمی املاح معدنی می باشد که برای سلامتی مهم است. چای سبز می تواند در کوتاه مدت متابولیسم را افزایش داده و اینگونه می تواند به کاهش وزن کمک کند. پلی فنول های چای سبز می تواند با کاهش رشد باکتری ها، خطر ابتلا به عفونت ها را کاهش دهد. همچنین می تواند به سلامت دهان و دندان کمک کرده و خطر پوسیدگی دندان را کاهش دهد.

پلی فنول های چای سبز، تشکیل رادیکا ل های آزاد موجود در بدن را کاهش داده و اینچنین بدن را در برابر بیماری هایی مانند آترواسکلروزیس، بیمار یهای قلبی-عروقی و سرطان ها محافظت می کند]7[ . همچنین در چندین مطالعه، پلی فنول های چای سبز اثرات بسیار ویژه ای را علیه بسیاری از میکروارگانیسم ها شامل: کوکسی های گرم مثبت و باسیلهای گرم منفی مانند: اشرشیا کلی، گونه های سالمونلا، استافیلوکوکوس اورئوس و گونه های انتروکوکوس و علیه برخی از قارچهای بیماریزا مانند: کاندیدا آلبیکنس و برخی از ویروس های مهم بیماریزا مانند:  HIV، HSV و ویروس آنفولانزا از خود نشان دادند.

مطالعات چریوت و همکاران در سال 2015 نشان داد که، عصاره ریشه چای سبز دارای  خواص ضد قارچی علیه گونه های کاندیدا شامل: کاندیدا تروپیکالیس 750ATCC ، کاندیدا فاماتا، کاندیدا لوسیتانیا وگونه های درماتوفیت ها شامل ترایکوفایتون منتاگروفایتیس می باشد. کاندیدا آلبیکنس و کریپتوکوکوس نئوفورمنس نسبت به عصاره ریشه چای سبز حساسیت نشان دادند.

در پژوهشی دیگر نتایج حاصل از مطالعات جیگیشا و همکاران در سال 2015 نشان داد که، عصاره های متانولی و استونی چای سبز دارای خواص آنتی باکتریال هستند. همچنین در ترکیب عصاره متانولی چای سبز با داروی آمپی سیلین بر روی دو باکتری استافیلوکوکوس اورئوس و سودوموناس آئروژینوزا اثرات هم افزایی مشاهده شد، به گونه ای که قطر هاله عدم رشد علیه استافیلوکوکوس اورئوس و سودوموناس آئروژینوزا به ترتیب از 07 / 0± 36 به 414 / 1± 39 میلیمتر و 07 / 0± 26 به 7/0±29]9[.

مادهورا و همکاران در سال 2016 ، اثرات ضد قارچی عصاره چای سبز بر روی قارچ های گونه کاندیدا به روش t-test در مقایسه با گروه شاهد اثبات کردند. لذا تاکنون مطالعاتی انجام پیرامون اثر ضد قارچی عصاره آبی و متانولی چای سبز به ویژه چای سبز ایرانی بر روی گونه های آسپرژیلوس صورت نپذیرفته و از طرفی تا به حال پژوهشی مبنی بر بررسی اثرات هم افزایی حاصل از ترکیب عصاره های آبی و متانولی چای سبز با دو داروی ایتراکونازول و وریکونازول صورت نگرفته است.

لذا در این پژوهش هدف ارزیابی فعالیت ضد قارچی عصاره آبی و متانولی چای سبز دامنه محصول شهر لاهیجان بر روی 4 سویه آسپرژیلوس موردنظر شامل آسپرژیلوس فلاووس 39ATCC ، آسپرژیلوس فومیگاتوس 278ATCC ، آسپرژیلوس ترئوس 274ATCC و آسپرژیلوس نایجر  9142 ATCC و بررسی اثرات هم افزایی این دو عصاره در ترکیب با ایتراکونازول و وریکونازول بود.

مواد و روش ها

میکروارگانیسم ها و محیط کشت: چهار سویه آسپرژیلوس شامل آسپرژیلوس فلاووس39 ATCC ، آسپرژیلوس فومیگاتوس

278ATCC ، آسپرژیلوس نایجر 9142 ATCC و آسپرژیلوس ترئوس 274ATCC از بخش قارچ شناسی دانشکده علوم پزشکی مازندران و دانشگاه علوم پایه شاهد تهیه و جهت کشت و انجام بررسی های مورد نظر به آزمایشگاه میکروبیولوژی دانشگاه آزاد کرج منتقل شد. محی طهای کشت سابورودکستروزآگار و RPMI1640 مربوط به شرکت ) Merck co. Jermany ( بود.

تهیه سوسپانسیون اسپور قارچ: جهت تهیه هر یک از سوسپانسیون های اسپور قارچ، مطابق پروتکل 38 – CLSI A2سال 2012 انجام شد. پس از کشت قارچ مورد نظر در اسلنت شیب دار سابورودکستروز آگار به مدت 2 هفته، برداشت اسپور توسط آب مقطر استریل و توئین80 (Merck co. Jermany) انجام و شیک شد. طول موج شمارش سوسپانسیون اسپور قارچ 530 نانومتر و محدوده جذب نوری برای 4 سویه آسپرژیلوس موردنظر به شرح زیر بود:

1)آسپرژیلوس فلاووس= 82 %- 78

2) آسپرژیلوس فومیگاتوس= %82-80

3) آسپرژیلوس نایجر= 82 %- 80

4) آسپرژیلوس ترئوس= 82 %- 80

زمانی که جذب نوری هرکدام از سوش های قارچی موردنظر در محدوده مناسب قرار گرفت، در این حالت هرکدام از سوسپانسیون ها حاوی 10⁶ اسپور بر میلی لیتر از قارچ مورد نظر بوده است. محیط کشت RPMI1640 استریل حاوی MOPS جهت تهیه سوسپانسیون اسپور قارچی مد نظر بود و رقت اسپور مطابق 38 – CLSI A2 برابر⁴ 10 اسپور بر میلی لیتر تهیه شد.

استوک داروهای ایتروکونازول و وریکونازول: به جهت تهیه استوک دارویی مقدار 0032 / 0 گرم ایتراکونازول و وریکونازول برحسب گرم مطابق فرمول زیر را با 5 میلی لیتر از DMSO خالص به عنوان حال داروها و همچنین رفع آلودگی های احتمالی باهم ترکیب شد. غلظت اولیه داروها 16 میکروگرم بر میلی لیتر بود. ترکیب را 30 دقیقه در دمای اتاق قرار داده تا داروها به طور کامل در DMSO حل شدند. 100 میکرولیتر از محلول حاصل را درون لوله آزمایش استریل ریخته و مقدار 900 میکرولیتر محیط کشت     RPMI1640   حاوی  MOPSاستریل به آن اضافه شد.

غلظت داروهای مورداستفاده درون اولین چاهک میکروپلیت الایزا 1/ 0 رقیق شده و معادل 64 میکروگرم بر میلی لیتر بود

مابقی چاهک ها به صورت سریال رقت معادل 32 ، 16 ، 8، 4،2، 1، 5/0 میکروگرم بر میلی لیتر لحاظ شد. رقت دارو توسط

محیط کشت RPMI1640 حاوی MOPS استریل انجام شد.

 

عصاره های آبی و متانولی برگ چای سبز: جهت تهیه عصاره های آبی و متانولی برگ های چای سبز، برگ های خشک شده این گیاه که حاصل کشت تازه سال 94 و محصول کارخانه تولید چای دامنه لاهیجان بود به روش خیساندن عصاره گیری شد. ابتدا 100 گرم از گیاه خردشده را درون دکانتور ریخته و 300 میلی لیتر از هر حال یعنی آب برای عصاره آبی و متانول برای عصاره متانولی به آن اضافه شد بطوریکه حال کاملاً سطح گیاه را پوشاند. جهت جلوگیری از تابش مستقیم نور خورشید و جلوگیری از تغییرات، عصاره گیری در منطق های دور از نور آنجا مشاهده و جهت جلوگیری از تبخیر حلال درب ظرف عصاره گیری محکم بسته شد.

عمل عصاره گیری را ضمن تکان دادن و هم زدن مکرر به مدت 5- 2 روز در حرارت اتاق انجام شد. سپس عصاره ها صاف شده و برای خروج حلال از آ نها عصاره ها به مدت 7- 5 روز در دمای محیط نگهداری شدند. سپس عصاره های حاصل، درون لوله فالکون های 15 میلی لیتری ریخته و با استفاده از دستگاه لیوفلیزاسیون دانشکده قار چشناسی پزشکی دانشگاه تربیت مدرس در دمای 30 – و طی مدت 2 روز، به پودر عصاره های آبی و متانولی چای سبز تبدیل شده و جهت انجام کار به آزمایشگاه میکروبیولوژی دانشگاه آزاد اسامی واحد کرج منتقل شدند و در طول مدت استفاده درون فریزر 20 – نگهداری گردیدند.

 

 

تهیه استوک عصاره های آبی و متانولی چای سبز:

جهت بررسی تأثیر ضد قارچی عصاره های آبی و متانولی چای سبز محاسبات به گون های انجام شد که غلظت هرکدام از عصار ه ها معادل 128 میکروگرم بر میلی لیتر در چاهک اول و رقت های بعدی درون چاهک های میکروپلیت از چپ به راست 5/ 0، 1، 2، 4، 8، 16 ، 32 ، 64 میکروگرم بر میلی لیتر در چاهک های دوم تا آخر شد. برای این کار مطابق پروتکل 38 – CLSI A2 غلظت چاهک اول را 40 برابر در نظر گرفته و سپس برای محاسبه وزن مقدار پودر عصاره های مورداستفاده، از فرمول زیر استفاده شد:

 

سپس مقدار 25 / 0 گرم از هرکدام از عصاره ها را وزن کرده و سایر مراحل مشابه ساخت استوک دو داروی ایتراکونازول و وریکونازول یکسان بود. در نهایت غلظت عصاره ها در چاهک اول معادل 128 میکروگرم بر میلی لیتر شدند.

تهیه استوک

ترکیب داروها و عصاره های باهم برای بررسی اثرات هم افزایی آن ها: جهت تهیه استوک ترکیب داروها و عصاره ها با هم تمامی مراحل مشابه تهیه استوک عصاره های آبی و متانولی انجام شد با این تفاوت که نصف مقدار وزنی داروها یا پودر عصاره های مورد آزمایش قرار گرفت (125/0=2 ÷25/0به عبارتی مقدارgr  125/0 از هرکدام از داروها و gr 125/0 از هرکدام از عصاره ها وزن شده و به ترتیب مخلوط شده و سایر مراحل مطابق تهیه استوک عصاره های آبی و متانولی انجام گرفت.

بررسی خاصیت ضد قارچی: بررسی ها برای تعیین حداقل غلظت مهاری داروها، عصاره ها و ترکیب آن ها برای بررسی اثر هم افزایی داروها و عصاره ها با هم مطابق پروتکل 38 – CLSI A2 به روش رقیق سازی درون میکروپلیت های 96 خانه الایزا انجام گرفت.

برای این منظور برای تعیین حداقل غلظت مهاری داروی ایتراکونازول به این صورت عمل شد که در شرایط کاملاً استریل، در تمامی چاهک های میکروپلیت به جز شاهد، مقدار 100 میکرولیتر RPMI1640 حاوی MOPS استریل ریخته شد، سپس به چاهک اول  100میکرولیتر  از استوک داروی ایتراکونازول اضافه شد و در مرحله بعد، 100 میکرولیتر از چاهک اول برداشته و تا چاهک آخر رقت سازی انجام گرفت و از چاهک آخر 100 میکرولیتر دور ریخته شد. به تمامی چاهک ها 100 میکرولیتر سوسپانسیون قارچی با غلظت 10⁴ افزوده شد.

برای بررسی دقیق نتیجه کار، یک چاهک را به عنوان شاهد منفی که شامل 100 میکرولیتر RPMI1640 حاوی MOPS استریل و میکرولیتر داروی ایتراکونازول لحاظ شد. درون چاهک دیگر به عنوان شاهد مثبت، 100 میکرولیتر RPMI1640 حاوی MOPS استریل و سوسپانسیون قارچی و همچنین یک چاهک دیگر نیز به عنوان شاهد مثبت در نظر گرفته شد که دارای 100 میکرولیتر (%5 DMSO ) و 100 میکرولیتر سوسپانسیون قارچی بود و نشان از عدم مهارکنندگی رشد اسپور توسط (%5 DMSO ) می باشد.

میکروپلیت ها را به مدت 3 تا 5 روز درون انکوباتور 35 درجه  قرار داده و از طریق مشاهده چشمی، کدورت چاهک ها را  از نظر رشد کلنی های قارچ و تعیین حداقل غلظت مهاری بررسی شد. حداقل غلظت مهاری سایر داروها و عصاره ها شامل ایتراکونازول، عصاره آبی چای سبز، عصاره متانولی چای سبز، و ترکیب دوبه دوی داروها و عصاره ها به همین روش بررسی شد.

حداقل غلظت قارچ کشی از هرکدام از چاهک ها که در آن رشد کلنی قارچی مشاهده شده بود و دو چاهک قبل از آن به کمک سوآب استریل به روش کشت چمنی بر روی محیط سابورودکستروز آگار کشت داده شد و سپس پلیت ها را درون انکوباتور 35 به مدت 5- 3 روز قرار داده و بعد از گذشت مدت زمان موردنظر تعداد کلنی های هر پلیت را مورد بررسی قرار می گرفت. هر پلیت که در آن کمتر از 4 کلنی قارچی مشاهده شد به عنوان حداقل غلظت قارچ کشی لحاظ شد.

بررسی های آماری: در این تحقیق، حداقل غلظت های مهاری و قارچ کشی داروها و عصاره ها و ترکیبات آنها از طریق مشاهده چشمی بعد از 5 بار تکرار تعیین و سپس با استفاده از نرم افزار آماری SPSS نسخه 20 ، تست چند دامنه ای دانکن برای داده های حاصل انجام شد.

 

یافته ها

داروی ایتروکونازل در مقایسه با داروی وریکونازول درنتیجه هم افزایی با عصاره های آبی و متانولی چای سبز ، دارای نتایجی مؤثر و مطلوب بود. این در حالیست که اثر هم افزایی وریکونازول با عصاره های یاد شده به استثنا قارچ فومیگاتوس عمدتاً فاقد ارزش بودند. بررسی ها بیانگر این بود که عصاره های آبی و متانولی چای سبز با نام دامنه محصول لاهیجان به تنهایی هیچ گونه اثر ضد قارچی بر روی سویه های آسپرژیلوس مورد نظر نداشتند. نتایج حداقل غلظت مهاری نشان دهنده وجود اثرات هم افزایی در ترکیباتی مانند ترکیب عصاره آبی چای سبز و داروی ایتراکونازول بر روی آسپرژیلوس فومیگاتوس 278 ATCC با حداقل غلظت مهاری 4 میکروگرم بر میلی لیتر بود.

این در حالی است که حداقل غلظت مهاری برای داروی ایتراکونازول به تنهایی 8 میکروگرم بر میلی لیتر برای قارچ یادشده گزارش شده بود (جدول شماره 1). حداقل غلظت مهاری در ترکیب هم افزایی عصاره آبی چای سبز و با 4 میکروگرم بر 278ATCC ایتراکونازول در آسپرژیلوس نایجر میلی لیتر در مقایسه با 16 میکروگرم بر میلی لیتر برای داروی ایتراکونازول به تنهایی گزارش شد. همچنین در ترکیب هم افزایی عصاره متانولی چای سبز و ایتراکونازول در آسپرژیلوس نایجر  9142ATCC، 4 میکروگرم بر میلی لیتر در مقایسه با 16 میکروگرم بر میلی لیتر داروی ایتراکونازول به تنهایی در این قارچ گزارش شد (جدول شماره 1).

 

ترکیب عصاره آبی چای سبز و وریکونازول در آسپرژیلوس فلاووس 39 ATCC با حداقل غلظت قارچ کشی 8 میکروگرم بر میلی لیتر در مقایسه با 16 میکروگرم بر میلی لیتر داروی وریکونازول در این قارچ و درنهایت در ترکیب عصاره آبی چای سبز و وریکونازول در آسپرژیلوس فومیگاتوس 278ATCC با 4 میکروگرم بر میلی لیتر در مقایسه با 8 میکروگرم برمیلی لیتر داروی وریکونازول در این قارچ بود.

از سوی دیگرنتایج حاصل نشان داد که بر اساس پروتکل CLSI دو سوش آسپرژیلوس فلاووس 39 ATCC و آسپرژیلوس ترئوس با 274ATCC هر دو با 5/ 0 میکروگرم بر میلی لیتر نسبت به داروی ایتراکونازول حساس و سویه آسپرژیلوس فومیگاتوس 278ATCC با میکروگرم بر میلی لیتر و آسپرژیلوس  نایجر 9142 ATCC با 16 میکروگرم بر میلی لیتر نسبت به ایتراکونازول مقاوم بودند.

از طرفی تمامی سویه های آسپرژیلوس مورد بررسی با دارا بودن حداقل غلظت مهاری بالاتر از 2 میکروگرم بر میلی لیتر نسبت به داروی وریکونازول مقاوم بودند. همانطور که در جدول شماره 1 و 2 مشاهده می کنید عصاره متانولی چای سبز به صورت هم افزایی با وریکونازول فاقد ارزش حداقل غلظت قارچ کشی و مهاری است و این در حالی است که ترکیب عصاره آبی چای سبز به جهت درمان آلودگی آسپرژیلوس فومیگاتوس ارزشمند گزارش می شود.

 

بحث

آسپرژیلوس ها ازجمله قارچ های ساپروفیتی می باشند که با ایجاد متابولیت های ثانویه و یا مایکوتوکسین هایی مانند آفلاتوکسین، می توانند برای سلامتی انسان مخاطره آفرین بوده و انواع مختلفی از عفونت ها، از آسم گرفته تا عفونت های منتشر خطرناک را، به خصوص در افراد دارای نقص ایمنی ایجاد نمایند.

تری آزول هایی مانند ایتراکونازول، وریکونازول و پوساکونازول برای درمان عفونت های مزمن و مهاجم ناشی از آسپرژیلوس ها شامل: آسپرژیلوزیس و آسپرژیلوما مورد استفاده قرار می گیرند، اما چالشی که وجود دارد این است که اخیراً مطالعات نشان داده اند که، مقاومت هایی نسبت به گروه تری آزول ها در  برخی گونه های آسپرژیلوس مثل آسپرژیلوس فومیگاتوس، آسپرژیلوس نایجر، آسپرژیلوس ترئوس و آسپرژیلوس فلاووس مشاهده شده است.

به جهت برطرف کردن این چالش استفاده از گیاهان دارویی مانند چای سبز پیشنهاد می شود. چای سبز دارای ترکیباتی به نام پلی فنول ها می باشد که، حدود 90-80 %  فلاوونوئیدهای موجود در چای سبز و 40 – 30 % وزن خشک چای سبز را تشکیل می دهند و مهم ترین ترکیب پلی فنولی آن EGCG )اپی گالو کاتچین 3- گالات( می باشد که این ترکیبات در بدن انسان دارای خواص ضد سرطان، پیشگیری کننده و کاهش دهنده بیمار یهای قلبی- عروقی، ضدالتهاب و همچنین خواص ضد میکروبی علیه باکتری ها، ویروس ها، انگل ها و قارچ های مختلف می باشد.

خواص ضد باکتریایی آن علیه باکتری هایی مانند: اشرشیا کلی، سالمونلا تیفی، سودوموناس آئروژینوزا، هلیکوباکتر پیلوری، پروتئوس میرابیلیس، لیستریا مونوسایتوژنز، باسیلوس سرئوس، سالمونلا تیفی موریوم، استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس، یرسینیا انتروکولیتیکا، ویبریو کلرا، استافیلوکوکوس اورئوس مقاوم به متی سیلین، استرپتوکوکوس موتانس، استرپتوکوکوس پایوژنز، پرووتا اینترمدیا، خواص ضد ویروسی آن علیه ویروس هایی مانند: اپشتین بار ویروس  (EBV) ، هپاتیت B و HIV1 و هپاتیت C هرپس سیمپلکس ویروس 1 ) HSV1 (، آنفولاتزا تیپ A H5N2 ,H3N2 ,H1N1 و آنفولانزا تیپ B، خواص ضد انگلی آن علیه انگلی مانند: تریپانوزوما کروزی و خواص ضد قارچی آن علیه قارچ هایی مانند: گونه های اکتینومایسس، آسپرژیلوس نایجر و کاندیدا آلبیکنس می باشد.

هاراماین و همکاران مطالعاتی را مبنی بر بررسی اثر ضد میکروبی عصاره های متانولی و آبی چای سبز چینی به روش انتشار در آگار، بر روی یک باکتری گرم مثبت مانند: استافیلوکوکوس اورئوس و پنج باکتری گرم منفی مانند: اشرشیا کلی، کلبسیلا پنومونیه، پروتئوس ولگاریس، سودوموناس آئروژینوزا و سالمونلا تیفی و همچنین دو قارچ استاندارد آسپرژیلوس نایجر و کاندیدا آلبیکنس انجام دادند. نتایج حاصل از این بررسی نشان داد که، عصاره متانولی برگ چای سبز اثرات ضد قارچی فراوانی را ( 24 تا 28 میلی متر) علیه تمام باکتری های مورد بررسی از خود نشان داد.

عصاره آبی چای سبز اثر ضد قارچی متوسطی را علیه اشرشیا کلی (16 میلی متر) نشان داد و بر باکتری های گرم مثبت و تمام باکتری های گرم منفی تست بی اثر بود. هر دو عصاره های آبی و متانولی چای سبز بر دو قارچ مورد آزمایش شامل کاندیدا آلبیکنس و آسپرژیلوس نایجر بی اثر بودند، نتایج این پژوهش در مورد بی اثر بودن عصاره های آبی و متانولی چای سبز بر آسپرژیلوس نایجر با نتیجه پژوهش ما که در آن هر دو عصاره آبی و متانولی چای سبز بر تمام سویه های قارچی ازجمله آسپرژیلوس نایجر بی اثر بودند مطابقت دارند.

نائینی و همکاران در سال 2017 مطالعاتی را مبنی بر بررسی اثر ضد قارچی عصاره آبی چای سبز بر روی گونه های مختلف کاندیدا شامل: کاندیدا آلبیکنس، کاندیدا گلابراتا، کاندیدا کروزه ای و کاندیدا تروپیکالیس به روش  punch hole method انجام دادند. در این پژوهش عصاره آبی چای سبز بر گونه های کاندیدای مورد آزمایش بی اثر (با قطر هاله عدم رشد) شناسایی شد. تمام موارد فوق صحت پژوهش انجاl شده را تأیید مd کرد.

اما آنچه باعث مزیت و برتری پژوهش انجاl شده است بررسی اثرات هl افزایی حاصل از ترکیب دو داروی ایتراکونازول و وریکونازول با دو عصاره آبی و متانولی چای سبز می باشد که برای اولین بار مورد پژوهش قرار گرفته است. نویسندگان مقاله نظر دارند که با توجه به گسترش مقاومت های دارویی و ناگزیری پژوهشگران به جایگزینی مناسب جهت هم افزایی ترکیبات طبیعی با داروهای شیمیایی می شود معضل مقاومت دارویی و اثرات منفی پیامدهای داروهایی شیمیای را با هم کاهش دهند.

همچنین با توجه به اینکه چای سبز Camelia Sinesis L از خشک کردن برگ های تازه چای حاصل می شود. این گیاه حاوی ترکیبات پلی فنولیک شامل اپی گالوکاتشین – 3- گالات ) –Epigallocatechin-3 gallate-EGCG (، اپی گالوکاتشین ) Epigallocatechin EGC ( ،اپی کاتشین ) Epicatechin-EC ( و اپی کاتشین گالاته) Epicatechin3-gallate (ECG است.. و با توجه به این نکته دنیا به سمت تحقیقات عمیق پیرامون اجزاء چای سبز پیش رفته است

پارک و همکاران در سال 2011 به بررسی اثر ضد قارچی اپی گالوکاتچین گالات موجود در چای سبز بر روی گونه های درماتوفیت شامل ترایکوفاتیون روبروم و ترایکوفاتیون مفتاگروفایستین پرداختند. در این پژوهش هر دوی این قارچ ها نسبت به اپی گالوکاتچین گالات حساس و دارای محدوده 4- 2 MIC50= میکروگرم بر میلی لیتر و 8- 4 MIC90= میکروگرم بر میلی لیتر بودند.

همچنین آبراهام و همکاران به بررسی اثر هم افزایی بین عصاره متانولی چای سبز با آنتی بیوتیک کلرامفنیکل با روش دیسک در پلیت و بررسی قطر هاله عدم رشد پرداختند و نتایج به دست آمده حاصل از این اثر هم افزایی به این صورت بود که برای اشرشیا کلی 16 میلی متر، انتروکوکوس فکالیس 24 میلی متر، سالمونلا تیفی 12 میلی متر، استافیلوکوکوس اورئوس 6 میلی متر، سودوموناس آئروژینوزا 10 میلی متر بود و بر روی آسپرژیلوس نایجر، کاندیدا آلییکس، فوزاریوم و ویبریو کلرا بی اثر بودند.

لذا پیشنهاد می شود جهت شناسایی و بررسی خواص ضدمیکروبی و ضد قارچی اجزاء ترکیبات مؤثر چای سبز ایران خصوصاً بر روی ترکیباتی که بیشترین درصد را در چای سبز دارا هستند، تحقیق شود.

گسترش بررسی بر روی تعداد بیشتری سویه های آسپرژیلوس خصوصاً آسپرژیلوس های جداسازی شده از بیماران بستری بررسی شود و ساختار شیمیایی داروها و همچنین ترکیبات  مؤثر موجود در عصاره چای سبز ایران از نظر ایجاد و یا عدم ایجاد پیوند های شیمیایی مؤثر ضد میکروبی نیز تحقیق صورت پذیرد. از طرفی دیگر پیشنهاد می شود که بر روی این ترکیبات با دیدگاه جایگزین مناسب مصرف داروی شیمیایی، آزمایشات موازی و مکمل انجام پذیرد تا در صورت موفقیت آمیز بودن آزمایشات، مقاومت دارویی و عوارض جانبی داروها کمرنگ تر شوند.

نتیجه گیری

با توجه به نتایج به دست آمده از حداقل غلظت مهاری حاصل از دو داروی ایتراکونازول و وریکونازول و عصاره های آبی و الکلی و ترکیب داروها و عصاره ها با هم، عصاره های آبی و متانولی چای سبز دامنه محصول لاهیجان هیچ گونه اثر ضد قارچی بر سوش های آسپرژیلوس مورد بررسی نداشتند که این نتایج مطابق با نتایج پژوهش های مشابه بود.

از طرفی نتایج حاصل از حداقل غلظت مهاری ترکیب داروها و عصاره ها نشان دهنده وجود اثرات هم افزایی در برخی از ترکیبات داروها و عصاره ها شامل: 1) ترکیب عصاره آبی چای سبز و ایتراکونازول در آسپرژیلوس فومیگاتوس  278ATCC 2) ترکیب عصاره آبی چای سبز و ایتراکونازول در آسپرژیلوس نایجر  9142 ATCC 3) ترکیب عصاره متانولی چای سبز و ایتراکونازول در آسپرژیلوس نایجر 9142ATCC  4) ترکیب عصاره آبی چای سبز و وریکونازول در آسپرزیلوس فلاووس  39ATCC 5)

ترکیب عصاره آبی چای سبز و وریکونازول در آسپرژیلوس فومیگاتوس 278ATCC  بود که نشان دهنده قابلیت جایگزین کردن این ترکیبات به جای دو داروی ایتراکونازول و وریکونازول و کاهش مسئله مقاومت و اثرات جانبی دارو می باشد. این بررسی برای اولین بار در پژوهش ما ارزیابی شده و نتایج حاصل از حداقل غلظت مهاری دو داروی ایتراکونازول و وریکونازول نشان دهنده حساسیت نیمی از سویه ها نسبت به ایتراکونازول و مقاومت تمامی سویه ها نسبت به وریکونازول بوده است.